第二代生物燃料以非糧作物乙醇、纖維素乙醇和生物柴油等為代表，原料主要使用非糧作物，秸稈、枯草、甘蔗渣、稻殼、木屑等廢棄物，以及主要用來生產生物柴油的動物脂肪、藻類等。
第二代生物燃料與第一代最重要的區別之一，就在於是否以糧食作物為原料。
據美國能源部研究，更注重生態效應的第二代生物燃料有望減少最高達96％的溫室氣體排放；而第一代以玉米為原料的燃料乙醇，平均僅可以減少約20％的溫室氣體排放。而且，第二代生物燃料，尤其是纖維素乙醇的取材範圍相當廣泛，秸稈、枯草等農業廢棄物均可入料。
肯亞在環保組織「綠色非洲基金會」幫助下，2007年底之前已經在1563萬平方米的土地上種植了200萬棵麻風樹。這種樹又被稱為「生物柴油樹」，經改性後的麻風樹油可適用於各種柴油發動機，並達到歐Ⅱ排放標準。在馬裏，有 700個社區已經在使用麻風樹生產的生物燃料來滿足能源需求。
作為世界上最大的使用非糧作物生產乙醇的國家，巴西近年來大量利用甘蔗渣發電，生產的電量已佔巴西全國發電總量的4%。
第二代生物能源需要很大的投資和大量的原材料，要實現工業化生產還很漫長。